高效液相色谱法(HighPerformance
Liquid Chromatography/HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。
高效液相色谱法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。今天,小析姐就来和你说说HPLC实验过程中经常会遇到的那些问题吧!
压力异常
操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象,并在右侧的列表中参考相应的解决方法。
A.没有压力显示,没有流动相流动
原因
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解决方法
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1.电源问题
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1.接通电源,开机
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2.保险丝被烧坏
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2.更换保险丝
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3.控制器设定不正确或设定失败
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3.a.采取恰当的设定b.修理或更换控制器
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4.柱塞杆折断
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4.更换柱塞杆
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5.泵头内有空气
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5.溶剂脱气、启动泵抽出空气
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6.流动相不足
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6.a.补充流动相b.更换入口滤头
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7.单向阀损坏
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7.更换单向阀
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8.漏液
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8.拧紧或更换手紧接头
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B.流动相流动正常,但没有压力显示
原因
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解决方法
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1.仪表损坏
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1.更换仪表
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2.压力传感器损坏
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2.更换压力传感器
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C.压力持续偏高
原因
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解决方法
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1.流速设定过高
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1.调整流速设定
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2.柱前筛板堵塞
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2.a.在允许情况下反冲色谱柱b.更换筛板c.更换色谱柱
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3.流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀
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3.a.使用恰当的流动相b.冲洗色谱柱
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4.色谱柱选择不当
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4.选择恰当的色谱柱
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5.进样阀损坏
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5.清洗或更换进样阀
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6.柱温过低
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6.提高温度
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7.控制器失常
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7.修理或更换控制器
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8.保护柱阻塞
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8.清洗或更换保护柱
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9.在线过滤器阻塞
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9.清洗或更换在线过滤器
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D.压力持续偏低
原因
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解决方法
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1.流速设定过低
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1.调整流速
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2.系统漏液
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2.确定漏液位置并维修
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3.色谱柱选择不当
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3.选择恰当的色谱柱
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4.柱温过高
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4.降低温度
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5.控制器失常
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5.维修或更换控制器
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E.压力不断上升
F.压力降为零
原因
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解决方法
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1.见列表A、B
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1.见列表A、B
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G.压力不断下降,但不回零
H.压力波动
原因
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解决方法
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1.泵中有气体
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1.a.溶剂脱气b.从泵中除去气体
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2.单向阀损坏
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2.更换单向阀
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3.泵密封损坏
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3.更换泵密封
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4.脱气不充分
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4.a.溶剂脱气b.改变脱气方法(使用在线脱气法等)
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5.系统漏液
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5.确定漏液位置并维修
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6.使用梯度洗脱
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6.由于流动相粘度的变化引起的压力波动
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漏液
通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题,但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题,就必须将接头取下,检查是否损坏(例如,卡套损坏、密封表面有杂质);损坏的接头应该更换掉。
A.接头处漏液
原因
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解决方法
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1.接头松动
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1.拧紧
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2.接头磨损
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2.更换
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3.接头过紧
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3.a.拧松,再重新拧紧b.更换
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4.接头被污染
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4.a.拆下清洗b.更换
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5.部件不匹配
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5.使用同一品牌的配件
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B.泵漏液
原因
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解决方法
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1.单向阀松动
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1.a.拧紧单向阀(不必拧的过紧)b.更换单向阀
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2.接头松动
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2.拧紧接头(不必拧的过紧)
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3.混合器密封损坏
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3.a.更换混合器密封b.更换混合器
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4.泵密封损坏
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4.维修或更换泵密封件
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5.压力传感器损坏
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5.维修或更换压力传感器
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6.脉冲阻尼器损坏
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6.更换脉冲阻尼器
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7.比例阀损坏
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7.a.检查隔膜,如果漏液立即更换b.检查手紧接头,损坏的立即更换
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8.放空阀的损坏
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8.a.拧紧放空阀b.更换放空阀
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C.进样阀漏液
原因
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解决方法
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1.转子密封损坏
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1.重新安装或更换进样阀
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2.定量环阻塞
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2.更换定量环
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3.进样口密封松动
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3.调整
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4.进样针头尺寸不合适
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4.使用恰当的进样针
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5.废液管中产生虹吸
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5.保持废液管高于废液液面
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6.废液管阻塞
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6.更换或疏通废液管
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D.色谱柱漏液
原因
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解决方法
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1.尾端接头松动
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1.拧紧接头
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2.卡套内有填料
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2.拆下、清洗卡套、重新安装
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3.筛板厚度不合适
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3.使用合适的筛板(参考下表)
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※筛板选择指导
物质粒径
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筛板孔径
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3-4u
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0.5u
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5-20u
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2u
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E.检测器漏液
原因
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解决方法
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1.流通池垫片损坏
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1.a.避免过大的背景压力(压力降)b.更换垫片
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2.流通池窗破碎
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2.更换窗口
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3.手紧接头漏液
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3.拧紧或更换
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4.废液管阻塞
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4.更换废液管
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5.流通池阻塞
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5.重新安装或更换
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液相色谱图
液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来,其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决;而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。
A. 峰拖尾
原因
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解决方法
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1.筛板阻塞
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1.a.反冲色谱柱b.更换进口筛板c.更换色谱柱
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2.色谱柱塌陷
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2.填充色谱柱
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3.干扰峰
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3.a.使用更长的色谱柱b.改变流动相或更换色谱柱
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4.流动相pH选择错误
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4.调整pH值。对于碱性化合物,低PH值更有利于得到对称峰
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5.样品与填料表面的溶化点发生反应图
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5.a.加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂b.更改色谱柱
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B.峰前延
原因
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解决方法
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1.柱温低
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1.升高柱温
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2.样品溶剂选择不恰当
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2.使用流动相作为样品溶剂
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3.样品过载
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3.降低样品含量
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4.色谱柱损坏
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4.见A1、A2
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C.峰分叉
原因
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解决方法
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1.保护柱或分析柱污染
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1.取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞,拆下来清洗。如果问题仍然存在,可能是柱子被强保留物质污染,运用适当的再生措施。如果问题仍然存在,入口可能被阻塞,更换筛板或更换色谱柱。
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2.样品溶剂不溶于流动相
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2.改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。
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D.峰变形
E.早出的峰变形
原因
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解决方法
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1.样品溶剂选择不恰当
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1.a.减少进样体积b.运用低极性样品溶剂
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F.早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原因
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解决方法
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1.柱外效应
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1.a.调整系统连接(使用更短、内径更小的管路);
b.使用小体积的流通池;
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G.K’增加时,脱尾更严重
原因
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解决方法
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1.二级保留效应,反相模式
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1.
a.加入三乙胺(或碱性样品)
b.加入乙酸(或酸性样品)
c.加入盐或缓冲剂(或离子化样品)
d.更换一支柱子
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2.二级保留效应,正相模式
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2.
a.加入三乙胺(或碱性样品)
b.加入乙酸(或酸性样品)
c.加入水(或多官能团化合物)
d.试用另一种方法
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3.二级保留效应,离子对
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3.加入三乙胺(或碱性样品)
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H.酸性或碱性化合物的峰拖尾
原因
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解决方法
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1.缓冲不合适
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a.使用浓度50-100mM的缓冲液
b.使用Pka等于流动相pH值的缓冲液
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I.额外的峰
原因
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解决方法
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1.样品中有其他组份
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1.正常
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2.前一次进样的洗脱峰
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2.
a.增加运行时间或梯度斜率
b.提高流速
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3.空位或鬼峰
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3.
a.检查流动相是否纯净
b.使用流动相作为样品溶剂
c.减少进样体积
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J.保留时间波动
原因
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解决方法
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1.温控不当
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1.调好柱温
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2.流动相组分变化
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2.防止变化(蒸发、反应等)
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3.色谱柱没有平衡
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3.在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
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K.保留时间不断变化
原因
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解决方法
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1.流速变化
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1.重新设定流速
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2.泵中有气泡
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2.从泵中除去气泡
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3.流动相选择不恰当
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3.
a.更换合适的流动相
b.选择合适的混合流动相
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L.基线漂移
原因
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解决方法
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1.柱温波动。(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。)
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1.控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器
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2.流动相不均匀。(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。)
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2.使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
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3.流通池被污染或有气体
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3.用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要,可以用1N的硝酸。(不要用盐酸)
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4.检测器出口阻塞。(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)
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4.取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。
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5.流动相配比不当或流速变化
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5.更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
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6.柱平衡慢,特别是流动相发生变化时
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6.用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
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7.流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。
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7.检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
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8.样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。
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8.使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
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9.使用循环溶剂,但检测器未调整。
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9.重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
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10.检测器没有设定在最大吸收波长处。
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10.将波长调整至最大吸收波长处。
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M.基线噪音(规则的)
原因
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解决方法
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1.在流动相、检测器或泵中有空气。
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1.流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
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2.漏液。
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2.见第三部分。检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音,如有必要,更换泵密封。
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3.流动相混合不完全。
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3.用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
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4.温度影响(柱温过高,检测器未加热)。
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4.减少差异或加上热交换器。
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5.在同一条线上有其他电子设备。
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5.断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
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6.泵振动。
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6.在系统中加入脉冲阻尼器。
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N.基线噪音(不规则的)
原因
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解决方法
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1.漏液
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1.见第三部分。检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要,更换密封。检查流通池是否漏液。
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2.流动相污染、变质或由低质溶剂配成
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2.检查流动相的组成。
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3.流动相各溶剂不相溶
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3.选择互溶的流动相
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4.检测器/记录仪电子元件的问题
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4.断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
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5.系统内有气泡
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5.用强极性溶液清洗系统
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6.检测器内有气泡
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6.清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器
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7.流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。)
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7.用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
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8.检测器灯能量不足
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8.更换灯
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9.色谱柱填料流失或阻塞
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9.更换色谱柱
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10.流动相混合不均匀或混合器工作不正常
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10.维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置
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O.宽峰
原因
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解决方法
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1.流动相组成变化
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1.重新制备新的流动相
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2.流动相流速太低
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2.调节流速
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3.漏液(特别是在柱子和检测器之间)
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3.见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。
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4.检测器设定不正确
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4.调整设定
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5.柱外效应影响
a、柱子过载
b.检测器对反应时间或池体积响应过大
c.柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d.记录仪响应时间太长
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5、
a、小体积进样(例如:10μL而不是100μL)以1:10或1:100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
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6.缓冲液浓度太低
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6.增加浓度
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7.保护柱污染或失效
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7.更换保护柱
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8.色谱柱污染或失效,塔板数较低
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8.更换同样类型的色谱柱,如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。
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9.柱入口塌陷
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9.打开柱入口,填补塌陷或更换柱子
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10.呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
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10.选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
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11.柱温过低
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11.提高柱温,除非特殊情况,温度不宜超过75℃
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12.检测器时间常数太大
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12.使用较小的时间常数
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P.分离度降低
原因
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解决方法
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1.流动相污染或变质(引起保留时间变化)
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1.重新配置流动相
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2.保护柱或分析柱阻塞
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2.去掉保护柱进行分析,如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞,可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。
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Q.所有的峰面积都太小
原因
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解决方法
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1.检测器衰减设定过高
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1.减少衰减的设定
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2.检测器时间常数设定太大
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2.设定较小的时间常数
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3.进样量太少
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3.增大进样量
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4.记录仪连接不当
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4.使用正确的连接
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R.所有的峰面积都太大
原因
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解决方法
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1.检测器衰减设定过低
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1.采取较大的衰减
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2.进样过多
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2.减少进样量
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3.记录仪连接不正确
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3.正确连接记录仪
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以下问题在使用进样阀过程中有可能发生
A.手动进样阀,转动不灵
原因
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解决方法
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1.转子密封损坏
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1.更换或调整转子密封
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2.转子太紧
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2.调整转子的松紧度
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B.手动进样阀,载样困难
原因
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解决方法
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1.进样阀安装不当
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1.重新安装
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2.定量环阻塞
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2.清洗或更换定量环
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3.进样器污染
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3.清洗或更换进样器
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4.管路阻塞
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4.清洗或更换管路
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C.自动进样阀,不能转动
原因
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解决方法
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1.无压力(或电源)
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1.提供恰当的压力(电源)
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2.转子太紧
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2.调整转子的松紧度
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3.进样阀安装不当
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3.重新安装
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D.自动进样阀,其它问题
原因
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解决方法
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1.阻塞
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1.清洗或更换阻塞部件
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2.机械故障
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2.见随机维修手册
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3.控制器故障
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3.维修或更换控制器
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由气味、景象和声音可以发现的问题
你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯,每天花上几分钟运用你的感官(除了味觉)来“感觉”你的液相色谱是否存在问题,这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如,在你看到漏液之前,你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。
A.溶剂的气味
原因
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解决方法
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1.漏液
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1.见section 3
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2.溅出
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a.检查废液瓶是否已满
b.找到溅出的部位并清洗干净
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B.热气味
原因
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解决方法
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1.仪器过热
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a.检查并调节通风设施
b.检查并调节温度设定
c.关掉仪器,查找维修手册
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C.读数不正常
原因
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解决方法
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1.压力不正常
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1.见section 2
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2.柱温箱问题
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2.
a.检查并调节设定
b.参照用户手册
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3.检测器灯失效
|
3.更换灯
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D.灯警告
原因
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解决方法
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1.压力超出极限值
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1.
a.检查是否阻塞
b.检查并调节极限值的设定
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2.其它警示灯
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2.见用户手册
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E.警告音
原因
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解决方法
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1.溶剂泄漏/溅出
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1.找到并解决
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2.其它警告音
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2.见用户手册
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F.刺耳的短音或长音
原因
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解决方法
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1.轴承失效
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1.见用户手册
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2.润滑不够
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2.进行恰当的润滑
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3.机械故障
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3.见用户手册
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常见故障及日常维护
下表中列出了液相色谱常见的一些问题,右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。
A.溶剂瓶
问题
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维护
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1.进口筛板阻塞;
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1.
a.更换(3-6个月)
b.过滤流动相,0.5μ滤膜
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2.气泡;
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2.流动相脱气;
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B.泵
问题
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维护
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1.气泡;
|
1.流动相脱气;
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2.泵密封损坏;
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2.更换(3个月);
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3.单向阀损坏;
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3.过滤流动相,运用在线过滤,准备备用单向阀;
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C. 进样阀
问题
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维护
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1.转子密封损坏
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1.a.不要拧的过紧b.过滤样品
|
D.色谱柱
问题
|
维护
|
1.筛板阻塞
|
1.
a.过滤流动相
b.过滤样品
c.运用在线过滤或保护柱
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2.柱头塌陷
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2.
a.避免使用pH>8的流动相(针对大部分硅胶的柱子);
b.使用保护柱;
c.使用预柱(饱和色谱柱);
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E.检测器
问题
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维护
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1.灯失效,检测器响应降低,噪音增大
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1.更换(6个月)或准备备用灯
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2.流通池有气泡
|
2.
a.保持流通池清洁
b.池后使用反压抑制器
c.流动相脱气
|
F.一般
问题
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维护
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1.腐蚀/摩擦损坏
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1.在不使用时保持系统缓冲液的清洁
|
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